众所周知， p53是一个拥有广泛而强大功能的抑癌基因。超过一半的肿瘤患者带有p53突变。p53基因敲除（KO）小鼠会在发育早期就形成肿瘤。自从1979年p53基因被发现以来，p53一直是分子生物学和肿瘤学的一个研究热门。在 Nature 杂志2017年的一项统计中，p53以绝对优势位列过去几十年最热门研究基因榜第一名。40多年的研究揭示了p53在抑制肿瘤中的多种作用机制。p53主要作为转录因子，激活或者抑制多种下游靶基因的转录来形式功能。这些靶基因的作用主要包括诱导细胞周期停滞，DNA修复，细胞代谢改变，细胞衰老，细胞凋亡，以及新近发现的诱导细胞发生铁死亡。p53的翻译后修饰，尤其是乙酰化修饰，对于其转录功能至关重要。顾伟教授作为p53乙酰化修饰的发现者，多年来从事p53乙酰化修饰和癌症的相关研究。利用p53-3KR (K120R，K161R和K162R) 突变小鼠模型，课题组发现p53在失去诱导细胞周期停滞，凋亡和衰老后，依然具有抑癌功能，进一步研究发现p53可以通过调节细胞代谢来抑制肿瘤。并且研究人员还发现，尽管p53无法激活p21和PUMA等众多基因的转录，但其在靶基因启动区的富集是没有改变的。所以，探索p53-3KR是如何失去其转录活性的机制成为了阐释p53转录激活调节中十分关键的问题。近日，美国纽约哥伦比亚大学癌症遗传研究所顾伟课题组在《Science Advances》期刊上发表了题为“An unexpected role for Dicer as a reader of the unacetylated DNA-binding domain of p53 in transcriptional regulation”的研究论文。该研究揭示了一个全新的p53负调控蛋白—Dicer，其可以作为非乙酰化p53的识别蛋白，对于p53转录激活起到调控作用。为了探索p53的DNA结合结构域上潜在的转录激活或抑制的蛋白，课题组首先构建SFB标签的p53-DBD+TD结构域的稳定表达的H1299细胞系。进一步利用蛋白质免疫共沉淀实验和联合质谱分析技术，研究人员鉴定出Dicer是主要且特异地与p53-DBD结合的蛋白。Dicer是一种核糖核酸内切酶，它可以将RNA切割降解为21-23bp的双链RNAs，对于microRNA 和siRNA的合成至关重要。由于Dicer的蛋白分子量为220kDa，因此研究人员为了证实他们的结合是特异的，首先通过一系列的蛋白质结构域分段免疫共沉淀实验发现Dicer 氨基酸1379到1551的肽段是主要和p53结合的区域。其次，通过一系列的内源免疫共沉淀实验证实在生理状态下p53也可以与Dicer结合，且结合存在于细胞核中。进一步的细胞学实验证实，Dicer确实可以调控p53的转录水平：1）Dicer敲除的HCT116细胞中尽管p53的蛋白水平没有变化，但是其下游基因p21和PUMA的mRNA和蛋白质水平均明显上升；2）共表达实验则证实Dicer能抑制p53的转录活性，且不依赖于Dicer的酶活性。这里值得一提的是，Dicer对于p53的下游基因调节是具有选择性的，MDM2和TIGAR则不会受到影响。此前研究发现，p53-3KR具有和野生型p53相同的激活MDM2和TIGAR转录的活性，因此Dicer选择性的转录调节提示研究人员，该现象可能和p53-3KR具有一定联系。通过结构域分段免疫共沉淀实验发现，Dicer主要和p53氨基酸100到180肽段结合。通过进一步蛋白质结合的实验，研究人员惊奇地发现Dicer与非乙酰化的p53-DBD结合能力显著地高于野生型p53，而且p53-DBD乙酰化则显著抑制这种相互作用。这提示p53-3KR之所以在不影响和下游基因启动区的结合的情况下能够抑制p53转录活性，很有可能是由于Dicer与p53-3KR的结合增强所导致的。为了研究Dicer对p53-3KR的调控作用，研究人员建立了四环素诱导的Tet-On鼠源p53野生型和p53-3KR突变型的H1299细胞系，进一步在p53-3KR细胞系中敲低Dicer。p53-3KR能够激活MDM2的表达，但不能激活p21或PUMA的表达，且敲低Dicer后的细胞能够再次激活p21或PUMA的表达。然而敲低另外两个关键的microRNA合成蛋白Drosha或DGCR8则不能够再次激活p21或PUMA的表达，充分说明在这过程中p53和Dicer相互作用是至关重要的。在p53-3KR小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 中敲低Dicer也能够观察到p21或PUMA的表达激活，证实这种调节在生理状态下也是发挥作用的。机制研究上，Dicer作为p53的转录共抑制因子，通过与p53的相互作用被招募到p53下游靶基因的启动子区，发挥抑制p53转录活性的作用。Dicer在不影响p53的蛋白稳定性以及p53在靶基因启动子区的结合能力的情况下，通过结合并募集甲基转移酶SUV39H1影响p53靶基因启动子区组蛋白H3K9的三甲基化水平并特异地调控p21和PUMA，而不影响MDM2和TIGAR的转录。本研究证实了p53转录激活需要多种方式，包括SET和Dicer多种负调节因子都可以在非应激和不影响p53蛋白质水平的情况下来激活p53，且这种调节是受p53乙酰化水平所控制的。本研究进一步证实应激条件下p53激活进而促进靶基因表达是通过p53表达上调和p53乙酰化来共同发挥作用的。参考资料：
[1] Xin Yang, et al. An unexpected role for Dicer as a reader of the unacetylated DNA-binding domain of p53 in transcriptional regulation. Science Advances. 2021. Doi：10.1126/sciadv.abi6684.
Sci. Adv. | 最新研究揭示全新的p53负调控蛋白—Dicer
发布时间：2021-10-29 17:30 文章来源：未知 作者：百替生物
[1] Xin Yang, et al. An unexpected role for Dicer as a reader of the unacetylated DNA-binding domain of p53 in transcriptional regulation. Science Advances. 2021. Doi：10.1126/sciadv.abi6684.